Em Trem-Bala, Ladybug (Brad Pitt) é um assassino azarado, determinado a fazer seu trabalho pacificamente depois de muitas missões saírem dos trilhos. Quase desistindo de sua carreira, ele é recrutado por Maria Beetle (Sandra Bullock) para coletar uma maleta em um trem-bala indo de Tóquio para Morioka.
O destino, no entanto, pode ter outros planos, pois a última missão de Ladybug o coloca em rota de colisão com adversários letais de todo o mundo – todos com objetivos conectados, mas conflitantes. A bordo estão os companheiros assassinos Kimura, Prince, Tangerine e Lemon.
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No trem mais rápido do mundo – um dos trens-bala Shinkansen, no Japão – Ladybug fica sob ameaça com uma bomba que explodirá automaticamente se o trem diminuir a velocidade abaixo de 80 quilômetros por hora, a menos que um resgate seja pago. E ele precisa descobrir como sair.
Trem-Bala acompanha a história do Joaninha (Brad Pitt), um assassino profissional que recebe uma última missão antes de tentar deixar para trás a antiga vida de altos riscos – especialmente porque se considera a pessoa mais azarada do mundo.
O problema é que a tarefa aparentemente simples de roubar uma maleta de dinheiro vai sair completamente de controle: o objeto está dentro de um trem que parte de Tóquio com destino à cidade de Quioto e, para o azar de Joaninha, os outro passageiros são basicamente as pessoas mais mortais do mundo.